1樓：匿名使用者
一、形態學觀察方法
1、he染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。
2、丫啶橙（ao）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。
此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、dna凝膠電泳
（一）檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞dna均發生斷裂，細胞內小分子量dn**斷增加，高分子dna減少，胞質內出現dn**斷。但凋亡細胞dna斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpdn**斷，而壞死細胞的dna斷裂點為無特徵的雜亂片斷，利用此特徵可以確定群體細胞的死亡，並可與壞死細胞區別。
（二）結果判斷
正常活細胞dna 電泳出現階梯狀（ladder）條帶；壞死細胞dna電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法（elisa）核小體測定
凋亡細胞的dna斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的dn**斷組成，可由elisa法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解後高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體；
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；
4、加辣過氧化物酶標記的抗dna抗體使之與核小體上的dna結合；
5、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml凋亡細胞。可用於人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。
四、流式細胞儀分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較準確
2）、可以做許多相關性分析
3）、結合被檢測細胞的dna含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞週期
■檢測形態學及細胞膜完整性的hoechs-pi雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介於正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用hoechs-pi染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（pi）而呈強的紅色熒光。
■dn**斷原位標記法
凋亡細胞dn**斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，dutp）和末端脫氧核苷酸轉移酶（tdt）相反應與凋亡細胞裂解後3.的羥基（－oh）端結合，經顯色反應後檢測dna裂解點的技術。
dn**段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（in situ nick-translation，isnt）技術，它是利用dna多聚酶i將標記的核苷酸連線到斷裂dna的3－oh端
2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique，isel），即tunel法，它是利用tdt將標記的dupt接到3－oh端。研究證明，tunel法的敏感性遠高於isnt，尤其對早期凋亡的檢測，tunel為合適。
■檢測細胞膜成分變化的annexin v 聯合pi法
1、原理：在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸（ps）遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白v（annexin v）是鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它於ps具有高度的結合力。
因此，annexin v可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對ps有高度親和力的annexin v，將annexin v標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素fitc），同時結合使用pi拒染法（因壞死細胞ps亦暴露於細胞膜外測，且對pi高染）進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷：正常活細胞annexin v 、pi均低染；凋亡細胞annexin v高染、pi低染；壞死細胞annexin v/pi均高染。
3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的ps外露早於dna斷裂發生，因此annexin v聯合pi染色法檢測早期細胞凋亡較tunel法更為靈敏。又annexin v聯合pi染色不需固定細胞，可避免pi染色因固定造成的細胞碎片過多及tunel法因固定出現的dn**段丟失。
因此，annexin v聯合pi法更加省時，結果更為可靠，是最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
2樓：太陽蛙蛙
幾種檢測凋亡的方法
一、形態學觀察方法
1、he染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。
2、丫啶橙（ao)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。
此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、dna凝膠電泳
（一）、檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞dna均發生斷裂，細胞內小分子量dn**斷增加，高分子dna減少，胞質內出現dn**斷。但凋亡細胞dna斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpdn**斷，而壞死細胞的dna斷裂點為無特徵的雜亂片斷，利用此特徵可以確定群體細胞的死亡，並可與壞死細胞區別。
（二）結果判斷
正常活細胞dna 電泳出現階梯狀（ladder)條帶；壞死細胞dna電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法（elisa)核小體測定
凋亡細胞的dna斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的dn**斷組成，可由elisa法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解後高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合‘
4、加辣過氧化物酶標記的抗dna抗體使之與核小體上的dna結合’
4、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用於人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。
四、流式細胞儀定量分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1)、檢測的細胞數量螅虼似浞從橙禾逑赴牡蟯鱟刺冉獻既?br>2)、可以做許多相關性分析
3)、結合被檢測細胞的dna含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞週期
■檢測形態學及細胞膜完整性的hoechs-pi雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介於正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用hoechs-pi染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（pi)而呈強的紅色熒光。
■dn**斷原位標記法
凋亡細胞dn**斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，dutp)和末端脫氧核苷酸轉移酶（tdt)相反應與凋亡細胞裂解後3·的羥基（－oh）端結合，經顯色反應後檢測dna裂解點的技術。
dn**段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（in situ nick-translation,isnt)技術，它是利用dna多聚酶i將標記的核苷酸連線到斷裂dna的3·－oh端
2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique,isel)，即tunel法，它是利用tdt將標記的dupt接到3·-oh端。研究證明，tunel法的敏感性遠高於isnt，尤其對早期凋亡的檢測，tunel更為合適。
■檢測細胞膜成分變化的annexin v 聯合pi法
1、原理：在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸（ps)遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白v（annexin v）是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它於ps具有高度的結合力。
因此，annexin v可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對ps有高度親和力的annexin v，將annexin v標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素fitc），同時結合使用pi拒染法（因壞死細胞ps亦暴露於細胞膜外測，且對pi高染）進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷：正常活細胞annexin v 、pi均低染；凋亡細胞annexin v高染、pi低染；壞死細胞annexin v/pi均高染。
3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的ps外露早於dna斷裂發生，因此annexin v聯合pi染色法檢測早期細胞凋亡較tunel法更為靈敏。又annexin v聯合pi染色不需固定細胞，可避免pi染色因固定造成的細胞碎片過多及tunel法因固定出現的dn**段丟失。
因此，annexin v聯合pi法更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
◆ 幾點參考
1.大部分凋亡細胞可能並不見得有非常典型的凋亡表型，如電鏡的染色體邊集、凋亡小體等，dna電泳也不見得都有dna ladder，但對某些指標來說還算穩定，如pi染色及tunel法，所以如果某個方法效果不好，可以換用其他方法檢測
2.壞死與凋亡的區分傳統上認為是無序與有序的過程，樓上所說的線粒體腫大也是以前的一個傳統認識，但現在有很多人認為壞死的發生也是有序發生的，因此也有了程式化壞死一說，在很大程度上，由於凋亡是時間依賴性的過程，細胞發生凋亡也並非同步化的，凋亡的晚期與壞死進行區分是困難的，而且我認為如果不是對於凋亡或是壞死本身通路進行研究的話，強行區分是沒有意義的。
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