1樓:雙子滴滴答答地
mtt法只bai
能用來檢測細胞相對du數和相對活zhi力,但不能測定細胞絕對數。dao在用酶標儀檢測專
結果屬的時候,為了保證實驗結果的線性,mtt 吸光度最好在0-0.7 範圍內。mtt一般最好現用現配,過濾後4°C避光儲存兩周內有效,或配製成5mg/ml儲存在-20°C長期儲存。
mtt的實驗方法
2樓:小希
1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下,96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有
e68a8462616964757a686964616f31333361303030105個細胞。但由於不同細胞貼壁後面積差異很大,因此,在進行mtt試驗前,要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線,確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間,以保證培養終止致細胞過滿。這樣,才能保證mtt結晶形成數量與細胞數呈的線性關係。
否則細胞數太多敏感性降低,太少觀察不到差異。
2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻,參考別人的結果再定個比較大的範圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間範圍再細篩。
切記!否則,可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3. 時間點的設定。在不同時間點的測定od值,輸入excel表,最後得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,曲線什麼時候變得平坦了(到了平台期)那個時間點應該就是最好的時間點(因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯)。
4.培養時間。200ul的培養液對於10的4~5次方的增殖期細胞來說,很難維持68h,如果營養不夠的話,細胞會由增殖期漸漸趨向g0期而趨於靜止,影響結果,我們是在48h換液的。
5.mtt法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數。做mtt時,盡量無菌操作,因為細菌也可以導致mtt比色od值的公升高。
6.理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
7.實驗時應設定調零孔,對照孔,加藥孔。調零孔加培養基、mtt、二甲基亞碸。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、mtt、二甲基亞碸,不同的是對照孔加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。
8.避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時,高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加,會試驗敏感性。
因此,一般選小於10%胎牛血清的培養液進行。在呈色後,盡量吸淨培養孔內殘餘培養液。 mtt 溶液的配製方法
通常,此法中的mtt 濃度為5mg/ml。因此,可以稱取mtt 0.5克,溶於100 ml的磷酸緩衝液(pbs)或無酚紅的培養基中,用0.
22μm濾膜過濾以除去溶液裡的細菌,放4°C 避光儲存即可。在配製和儲存的過程中,容器最好用鋁箔紙包住。
需要注意的是,mtt法只能用來檢測細胞相對數和相對活力,但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候,為了保證實驗結果的線性,mtt 吸光度最好在0-0.7 範圍內。
mtt一般最好現用現配,過濾後4°C避光儲存兩周內有效,或配製成5mg/ml儲存在-20度長期儲存,避免反覆凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把mtt粉分裝在ep管裡,用的時候現配,直接往培養板中加,沒必要一下子配那麼多,尤其當mtt變為灰綠色時就絕對不能再用了。
mtt有致癌性,用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的mtt需要無菌,mtt對菌很敏感;往96孔板加時不避光也沒有關係,畢竟時間較短,或者你不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉.
配製mtt時用用pbs溶解,也有人用生理鹽水配,60°C水浴助溶。
pbs配方:
nacl 8g
kcl 0.2g
na2hpo4 1.44g
kh2po4 0.24g
調ph 7.4
定容1l 1、收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔,(邊緣孔用無菌pbs填充)。
2.、5%co2,37°C孵育,至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上,細胞貼壁後即可加藥,或兩小時,或半天時間,但我們常在前一天下午鋪板,次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個,否則難以反應真實情況。
3.、5%co2,37°C孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
4、每孔加入20ulmtt溶液(5mg/ml,即0.5%mtt),繼續培養4h。若藥物與mtt能夠反應,可先離心後棄去培養液,小心用pbs衝2-3遍後,再加入含mtt的培養液。
5、終止培養,小心吸去孔內培養液。
6、每孔加入150ul二甲基亞碸,置搖床上低速振盪10min,使結晶物臢(zā)充分溶解。在酶聯免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。
7、同時設定調零孔(培養基、mtt、二甲基亞碸),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、mtt、二甲基亞碸)。 1、收集對數期細胞,調節細胞懸液濃度1×106/ml,按次序將1補足的1640(無血清)培養基40ul ;2加actinomycin d(有毒性)10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml,需預試尋找最佳稀釋度,1:10-1:
20);3需檢測物10ul;4細胞懸液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設對照(加100ml 1640)。
2、置37°C,5%co2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。
3、每孔加入10 ul mtt溶液(5 mg/ml,即0.5%mtt),繼續培養4 h。(懸浮細胞推薦使用wst-1,培養4 h後可跳過步驟4,直接酶聯免疫檢測儀od570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)。
4、離心(1000轉x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亞碸,置搖床上低速振盪10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀od570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。 細胞過了30代以後就不要用了,因為狀態不好了;培養板要用好的(最好進口板),不好的板或重複利用的板只可做預實驗。
接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種,因為細胞密度在10000/ml左右時,所測得的od值的區間即細胞抑制率(或者增值率)的所呈現的線性關係最好,結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯,太密細胞可能都會凋亡,因為細胞長的太快營養會不夠,最後導致死亡。且而細胞過密或者過少,增殖都會過快或者過慢,其增值率線性關係不佳。
故而mtt細胞密度多採用10000/ml,100ul/孔。
細胞密度要根據不同細胞的特點來定。如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那麼取小點的細胞濃度,如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那麼取大點的細胞濃度,這樣與對照的區別更明顯,資料更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104。
其它的聲音
1.首先細胞的接種密度一定不能過大,一般每孔1000個左右就夠了,我認為寧少勿多。尤其是對於腫瘤細胞。10000/孔是太高了,這樣即使藥物有作用,mtt方法也是表現不出的,最佳點板濃度在4000-5000/孔,太少的話sd值會很大。
(對於不同的細胞,每孔細胞數要摸索一下,對照組od在1.4以下為佳,當然通常來說更不要超過2。)
2.mtt本身就是比較粗的實驗,增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手,20%的波動也是常見的,所以很可能是技術原因引起的,特別是種板技術一定要過關。
3.我做的是腫瘤細胞的mtt實驗,這種細胞長的很快一開始我是用100000/ml的濃度來接種的,結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關係。後來調整濃度,用過40000~80000/ml的濃度都做過mtt實驗,結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ml的濃度組的。用40000/m的濃度的組,由於細胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關係。
還有根據細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養時間是48小時還是72小時。
注意細胞懸液一定要混勻,以避免細胞沉澱下來,導致每孔中的細胞數量不等,可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練,盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多,但是如果操作不熟,cv會在8%左右。
另外,吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練些、快些上板。
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