1樓：藍般若戀
elisa操作步驟（雙抗體夾心法）
1. 包被過程(注意設定空白對照,陰性對照):
將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體，(為避免蒸發,板上應加蓋或將板平放在底部有溼紗布的金屬溼盒中)。
2.pbs洗3次，每次3分鐘。
具體為：吸乾或甩幹孔內反應液；用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注板孔後，即甩去）；浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；吸乾孔內液體，可甩去液體後在清潔毛巾或吸水紙上拍幹；重複操作滌3次。
3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):
檢測時一般採用1:50-1:400的稀釋度, 應採用較大稀釋體積進行,一般保證樣品吸取量》20μl。
將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每樣品至少加雙孔，每孔100μl，置於37℃,40-60min。
4 .pbs洗3次，每次3分鐘。
5. 加入酶標抗體:
酶標抗體:根據酶結合物提供商提供的參考稀釋度進行或建立濃度梯度，37℃30-60min之間，短於30min往往結果不穩定，每孔加100μl。
6 .pbs洗3次，每次3分鐘。
7. 加入底物液(現用現配):
tmb(四甲基聯苯胺)使用液:tmb(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩衝液(ph5.
5)10ml0.75％h2o232μl，底物加入量每孔100μl（tmb空白顯色孔除外）,置37℃避光放置20-25分鐘。
8. 終止反應:
每孔加入終止液50μl(2m h2so4)終止反應, 此時藍色立轉黃色，於20min內測實驗結果。
9.結果判斷:
可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。也可測吸光值：
在elisa檢測儀上，tmb反應產物檢測需要450nm波長，檢測時一定要首先進行空白孔系統調零。用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(p/n)表示，當p/n大於2時作為抗體的效價即大於陰性對照吸光值的2倍，(數值的大小依具體檢測要求而定)。
2樓：匿名使用者
（1）單抗包被-抗原-酶標二抗-底物顯色。
本法首先也是用特異性抗體包被於固相載體，經洗滌後加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被於固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌後，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌後，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
（2）單抗包被-抗原-二抗-酶標二抗-底物顯色。(改良雙抗體夾心法)本法首先是將特異性抗體a包被於固相載體，經洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經孵育洗滌後再加一次未標記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b於第一次包被於固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫製備的，否則可出現非特異性反應。
經孵育洗滌後，再加酶標記抗b抗體，再經孵育洗滌後加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。
同時避免標記特異性抗體，而另一優點是隻要標記一種抗抗體，即可達到多種應用。
3樓：匿名使用者
你說的是雙抗體夾心法吧！它是用來測抗原的！例如測乙肝病毒的表面抗原，如果陽性可以說明得乙肝了！步驟： 1.平衡20min（把需要的東西準備好，保證實驗
4樓：匿名使用者
雙抗體夾心的意思是包被抗體-檢測抗原-酶標抗體形成夾心結構。
至於是單抗或者多抗都可以。
如果是酶標二抗（二抗就是抗抗體）的話，一般是包被抗原-抗體-酶標二抗，這種是間接法的
elisa中雙抗體夾心法與間接法的區別在哪
5樓：南京金益柏生物科技****
雙抗體夾心法：
(1) 包被：用0.05m ph9.
牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。
次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
(2) 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
(3) 加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
(4) 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的tmb底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
(5) 終止反應：於各反應孔中加入2m硫酸0.05ml。
(6) 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。
也可測o·d值：在elisa檢測儀上，於450nm(若以abts顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔o·d值，若大於規定的陰性對照od值的2.1倍，即為陽性。
間接法：
用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.
1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最後一遍用ddw洗滌。其餘步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
雙抗夾心法制備elisa試劑盒時。怎麼確定包被用抗體濃度？
做elisa的關鍵步驟是什麼，做ELISA的關鍵步驟是什麼？
elisa關鍵是訂乙個可靠的試劑盒。如果盒子已經訂了，剩下的就是自己操作了。乙個，盡量用八道或者十二道移液器加樣。對於相同的試劑，經如二抗，酶，顯色液，終止液等。另乙個，自己的樣品，因為每一孔的樣品不一樣，用排槍加有些麻煩，如果一次的樣品比較少，而自己加樣又比較快，可以乙個孔乙個孔的加，但如果想一次...
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