1樓:糟油酒丸
答色實驗):
光圈。光圈開得大,顧名思義所有光訊號包括背景訊號都會增強。
**時間。光訊號再強,你只選取其中很少一部分來成像,也能夠控制影象中的訊號強度。
樣品/玻片本身的自發螢光。
樣品的非特異性染色。
總體是乙個所有檢測手段中共通的問題,即訊雜比,訊號與雜訊比率。
1,2對訊雜比影響不大,在背景過強時很難通過調整1,2來解決問題。如果背景不存在過強問題,則通過1確保有用訊號足夠強,通過2減低**時間至背景充分黑暗即可。
3,4才是控制訊雜比的關鍵因素。自發螢光無法完全避免,只能通過選取自發螢光較低的材料來控制,另外固定及染色過程中的一些試劑有可能影響樣本的自發螢光。非特異性染色是更為常見的造成背景問題的原因,通過優化封閉條件,抗體/試劑用量,染色時長與溫度等條件來調整。
螢光顯微鏡原理 15
2樓:千書僅剩
螢光顯微鏡是一種較為常用的的光學顯微鏡,其基本原理是利用一定波長的激發光對樣品進行激發,使之產生一定波長的螢光,從而用於對樣品結構或其組分進行定性、定位、定量觀察檢測。
螢光顯微鏡是用短波長的光線照射用螢光素染色過的被檢物體,使之受激發後而產生長波長的螢光,然後觀察。螢光顯微鏡廣泛應用於生物,醫學等領域。
(1)螢光顯微鏡一般分為透射和落射式兩種型別。
a.透射式:激發光來自被檢物體的下方,聚光鏡為暗視野聚光鏡,使激發光不進入物鏡,而使螢光進入物鏡。
它在低倍情況下明亮,而高倍則暗,在油浸和調中時,較難操作,尤以低倍的照明範圍難於確定,但能得到很暗的視野背景。透射式不使用於非透明的被檢物體。
b.落射式:透射式目前幾乎被淘汰,新型的螢光顯微鏡多為落射式,光源來自被檢物體的上方,在光路中具有分光鏡,所以對透明和不透明的被檢物體都適用。
由於物鏡起了聚光鏡的作用,不僅便於操作,而且從低倍到高倍,可以實現整個視場的均勻照明。
優點:檢出能力高
對細胞的刺激小
能進行多重染色
用途:物體構造的觀察
螢光的有無、色調比較進行物質判別
發螢光量的測定對物質定性、定量分析
螢光顯微鏡的工作原理
3樓:刷粉勒僁
多採用200w的超高壓汞燈作光源,它是用石英玻璃製作,中間呈球形,內充一定數量的汞,工作時由兩個電極間放電,引起水銀蒸發,球內氣壓迅速公升高,當水銀完全蒸發時,可達50~70個標準大氣壓力,這一過程一般約需5~15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫外和藍紫光,足以激發各類螢光物質,因此,為螢光顯微鏡普遍採用。
超高壓汞燈也散發大量熱能。因此,燈室必須有良好的散熱條件,工作環境溫度不宜太高。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,使用一些時間後,則需要高壓啟動(約為15000v),啟動後,維持工作電壓一般為50~60v,工作電流約4a左右。200w超高壓汞燈的平均壽命,在每次使用2h的情況下約為200h,開動一次工作時間愈短,則壽命愈短,如開一次只工作20min,則壽命降低50%。因此,使用時儘量減少啟動次數。
燈泡在使用過程中,其光效是逐漸降低的。燈熄滅後要等待冷卻才能重新啟動。點燃燈泡後不可立即關閉,以免水銀蒸發不完全而損壞電極,一般需要等15min。
由於超高壓汞燈壓力很高,紫外線強烈,因此燈泡必須置燈室中方可點燃,以免傷害眼睛和發生**時造成操作。
超高壓汞燈(100w或200w)光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節燈泡發光中心的系統,燈泡球部後面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,前面安裝有集光透鏡。
國產超高壓汞燈gcq-200型效能良好,可以代替hbo-200等型的進口燈泡,平均壽命在200h以上,**也比較低。
我國研製的一種簡易輕便型高色溫溴鎢螢光光源裝置,體積小,重量輕,功率小,交、直流兩用(自帶直流電源),易於攜帶,使用方便,已推廣應用。 濾色系統是螢光顯微鏡的重要部位,由激發濾板和壓制濾板組成。濾板型號,各廠家名稱常不統一。
濾板一般都以基本色調命名,前面字母代表色調,後面字母代表玻璃,數字代表型號特點。如德國產品(schott)bg12,就是種藍色玻璃,b是藍色的第乙個字母,g是玻璃的第乙個字母;我國產品的名稱已統一用拼音字母表示,如相當於bg12的藍色濾板名為qb24,q是青色(藍色)拼音的第乙個字母,b是玻璃拼音的第乙個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名,如k530,就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。
還有的廠家的濾板完全以數字命名,如美國corning廠的no:5-58,即相當於bg12。
1.激發濾板 根據光源和螢光色素的特點,可選用以下三類激發濾板,提供一定波長範圍的激發光。
紫外光激發濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為ug-1或ug-5,外加一塊bg-38,以除去紅色尾波。
紫外藍光激發濾板:此濾板可使300~450nm範圍內的光通過。常用型號為zb-2或zb-3,外加bg-38。
紫藍光激發濾板:它可使350~490nm的光通過。常用型號為qb24(bg12)。
最大吸收峰在500nm以上者的螢光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如b-7)激發。
開始採用金屬膜干涉濾板,由於針對性強,波長適當,因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德leitz廠的fitc專用kp490濾板和羅達明的s546綠色濾板,均遠比玻璃濾板效果好。
激發濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野螢光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的螢光和最好的背景為準。
2.壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發光通過,提供相應波長範圍的螢光。與激發濾板相對應,常用以下3種壓制濾板:
紫外光壓制濾板:可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與ug-1或ug-5組合。常用gg-3k430或gg-6k460。
紫藍光壓制濾板:能通過510nm以上波長的光(綠到紅),能與bg-12組合。通常用og-4k510或og-1k530。
紫外紫光壓制濾板:能通過460nm以上波長的光(藍到紅),可與bg-3組合,常用og-11k470ak 490,k510。 專為螢光顯微鏡設計製作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃製成。
分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差螢光聚光器。
1.明視野聚光器 在一般螢光顯微鏡上多用明視野聚光器,它具有聚光力強,使用方便,特別適於低、中倍放大的標本觀察。
2.暗視野聚光器 暗視野聚光器在螢光顯微鏡中的應用日益廣泛。因為激發光不直接進入物鏡,因而除散射光外,激發光也不進入目鏡,可以使用薄的激發濾板,增強激發光的強度,壓制濾板也可以很薄,因紫外光激發時,可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產生黑暗的背景。從而增強了螢光影象的亮度和反襯度,提高了影象的質量,觀察舒適,可能發現亮視野難以分辨的細微螢光顆粒。
3.相差螢光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用,可同時進行相差和螢光聯合觀察,既能看到螢光影象,又能看到相差影象,有助於螢光的定位準確。一般螢光觀察很少需要這種聚光器。 螢光顯微鏡ccd一般具有良好的弱光捕捉能力,能夠捕捉到極其微弱的螢光,因此成像能力好,此外,很多螢光冷ccd生產上搜對此類ccd作了製冷處理,使得此類ccd的噪音大大降低,訊雜比得以很大的提高。
由於其方便應用效果,此類ccd相機被廣泛應用於螢光顯微鏡。
倒置螢光顯微鏡與雷射共聚焦顯微鏡有什麼區別
雷射共聚焦顯微鏡是採用雷射作為光源,在傳版統光學顯微權鏡基礎上採用共軛聚焦原理和裝置,並利用計算機對所觀察的物件進行數字圖象處理的一套觀察 分析和輸出系統。主要系統包括雷射光源 自動顯微鏡 掃瞄模組 包括共聚焦光路通道和針孔 掃瞄鏡 檢測器 數字訊號處理器 計算機以及圖象輸出裝置 顯示器 彩色印表機...
顯微鏡的種類，顯微鏡有哪些種類
顯微鏡有哪些種類 1 顯微鏡以顯微原理進行分類可分為偏光顯微鏡 光學顯微鏡與電子顯微鏡和數碼顯微鏡。2 偏光顯微鏡是用於研究所謂透明與不透明各向異性材料的一種顯微鏡，在地質學等理工科專業中有重要應用。3 光學顯微鏡通常皆由光學部分 照明部分和機械部分組成。光學顯微鏡可把物體放大1600倍，分辨的最小...
誰發明了顯微鏡，顯微鏡是誰發明的
最早的顯微鏡是16世紀末期在荷蘭製造出來的。發明者是亞斯 詹森,荷蘭眼鏡商，或者另一位荷蘭科學家漢斯 利珀希，他們用兩片透鏡製作了簡易的顯微鏡，但並沒有用這些儀器做過任何重要的觀察。1931年，恩斯特 魯斯 過研製電子顯微鏡。這使得科學家能觀察到像百萬分之一公釐那樣小的物體。1986年他被授予諾貝爾...