1樓:南京金益柏
選用插入基因的其中一條引物+載體上的一條引物只要不使用你目的回基因的2條引物,一般不答會出現假陽同意載體+插入片段引物,建議加個單純載體作為陰性對照~插入片段小的話載體正反引物+插入片段正反引物複測,祝你好運
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
2樓:匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化,最後做鑑定時,以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後,以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測,再重新以菌液為模板進行pcr檢測,因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果,推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的,此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助,也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好,雖然有假陽性的可能,但是只要是做出來,有目的條帶一般是對的,你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了,我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了,因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌,所以就沒有質粒,怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的乙個菌落挑出來的,如果不是,那肯定只有乙個是正確的,我做過,只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看,祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌,然後提取質粒,然後以質粒為模板做pcr,陽性的質粒再酶切進行鑑定,效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點,不確定對不對,借道跟大家討論一下,不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確,那我以前很多關於t載體的看法就錯了,所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪,以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌,然後以菌液為模板進行pcr,再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定,排除陰性管,這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性,所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過,也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大,我倒是碰到過菌液pcr是陰性,但是有質粒的情況,酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話,可以用水洗滌離心幾次,然後重懸於水,就可以了。 題外話:最近菌落pcr,陰性和陽性對照經常不擴增,而樣品擴增,鬱悶啊。
3樓:匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見,一般把電壓調低點跑久點會改善,有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況,注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做轉殖的時候,陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶,就像你最後乙個泳道。老闆說是汙染了,把所有的試劑全部換新的,而且加樣條件也非常注意,後來就沒有條帶了。
4樓:匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下,假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
菌落pcr假陽性
5樓:百浩生物
78道應該bai是理想的結果,如果du你放在mark兩邊的zhi話,應該沒有偏dao離。而12道,如果版優化一下,比如不用菌落權dna而是提純dna的話,也許會有好的結果。條帶兩端上揚是因為你的上樣濃度大了。
可以稀釋幾倍試一下。
6樓:匿名使用者
條帶咋看起來很亂呢。
上揚到不是問題,主要看起來同一目的基因,位置相差較大。
如果怕假陽性的話,可以試試看,挑了菌落放2 ml培養基搖到渾濁,然後再轉接到2 ml裡。再搖到渾濁,做pcr。
菌落pcr檢測有條帶,但是測序結果根本沒有連上,是什麼原因
7樓:匿名使用者
菌落baipcr的假陽性很多,也有du很多原因,所以一zhi般都是需要測序結果佐證的。
dao1,引物設計不合適專:選擇的擴增屬序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行 pcr 擴增時,擴增出的 pcr 產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。
需重新設計引物。
2,靶序列或擴增產物的交叉汙染:這種汙染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉汙染,導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,與引物互補後,可擴增出 pcr 產物,而導致假陽性的產生,可用巢式 pcr 方法來減輕或消除。
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