1樓:鴿子最純
聚合酶鏈式反應 ( pcr) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 。在擴增反應結束之後,版我們可以通過凝膠電泳權的方法對擴增產物進行定性的分析,也可以通過 放射性核素摻入標記後的光密度掃瞄來進行定量的分析 。無論定性還是定量分析,分析的都是 pcr 終產物。
但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經 pcr 訊號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下螢光定量 pcr 技術應運而生。
所謂的實時螢光定量 pcr 就是 通過對 pcr 擴增反應中每乙個迴圈產物螢光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時螢光定量 pcr 反應中,引入了一種螢光化學物質,隨著 pcr 反應的進行, pcr 反應產物不斷累計,螢光訊號強度也等比例增加。每經過乙個迴圈,收集乙個螢光強度訊號,這樣我們就可以通過螢光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條螢光擴增曲線圖。
實時螢光定量pcr內參是什麼東西
2樓:禾鳥
1、實時螢光定量pcr內參:
在不同的pcr反應管中已定量的內參和引物,內參用基因工程方法合成。上游引物用螢光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內參也被擴增。
在pcr產物中,由於內參與靶模板的長度不同,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其螢光強度,以內參為對照定量待檢測模板。
2、選擇:內參一般是固定的,可以用實驗室之前就有的。或者用基因工程方法合成。上游引物用螢光標記,下游引物不標記。
擴充套件資料
(1)內參在傳統定量中的作用:
由於傳統定量方法都是終點檢測,即pcr到達平台期後進行檢測,而pcr經過對數期擴增到達平台期時,檢測重現性極差。同乙個模板在96孔pcr儀上做96次重複實驗,所得結果有很大差異,因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。
加入內參後,可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
(2)內參對定量pcr的影響:
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標,則pcr反應變為雙重pcr,雙重pcr反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭,尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時,這種競爭會表現得更為顯著。
但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的,所以無法加入合適數量的已知模板作為內參。也正是這個原因,傳統定量方法雖然加入內參,但仍然只是一種半定量的方法。
3樓:小笑聊情感
實時螢光定量pcr內參是一種在dna擴增反應中,以螢光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(pcr)迴圈後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進行定量分析的方法。
4樓:匿名使用者
內參就是乙個表達量在各個組基本保持不變的基因,又叫看家基因,比如常用的gapdh, actin。或者18s rrna也可以。
如果內參表達量一致,說明你pcr的上樣量一致,樣本的質量也一致。如果出入很大,說明你的樣本的濃度或者是質量有問題。測到的目的基因的表達量就不可靠了
5樓:匿名使用者
管家基因,具體可以諮詢公司,也可以自己看文獻,常用的有gapdh,beta-actin和18srna,根據不同的**選用不同的管家基因,比如gapdh就被人詬病做癌細胞基因時超不准。。。
6樓:xueling黃
如果對內參要求很高的話,可以篩選合適內參,有免費的軟體,比如genorm,normfinder等
實時螢光定量pcr技術原理是什麼?
7樓:匿名使用者
聚合酶鏈式反應 ( pcr) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 。在擴增反應結束之後,我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析,也可以通過 放射性核素摻入標記後的光密度掃瞄來進行定量的分析 。無論定性還是定量分析,分析的都是 pcr 終產物。
但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經 pcr 訊號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下螢光定量 pcr 技術應運而生。
所謂的實時螢光定量 pcr 就是 通過對 pcr 擴增反應中每乙個迴圈產物螢光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時螢光定量 pcr 反應中,引入了一種螢光化學物質,隨著 pcr 反應的進行, pcr 反應產物不斷累計,螢光訊號強度也等比例增加。每經過乙個迴圈,收集乙個螢光強度訊號,這樣我們就可以通過螢光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條螢光擴增曲線圖。
生物幫上面有相關知識, http://****bio1000.
***/zt/cell/201378.html 動物細胞培養, 植物細胞培養, es細胞(胚胎幹細胞)培養, 細胞懸浮培養, 貼壁細胞培養。
8樓:俎新月武鈴
所謂的實時螢光定量
pcr就是
通過對pcr
擴增反應中每乙個迴圈產物螢光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。其原理是在實時螢光定量
pcr反應中,引入了一種螢光化學物質,隨著pcr反應的進行,
pcr反應產物不斷累計,螢光訊號強度也等比例增加。每經過乙個迴圈,收集乙個螢光強度訊號,這樣我們就可以通過螢光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條螢光擴增曲線圖。
實時螢光定量pcr與普通pcr的區別是什麼?結果有何異同?能說明的問題是什麼?
9樓:麼破1自我
二者結果相同。都能說明生物體外的特殊dna複製的整個過程的擴增效率和溶解溫度情況。
區別:1、二者系統組成不同
螢光定量pcr儀比普通的pcr儀多了螢光訊號採集系統和計算機分析處理系統。
2、二者原理不同
螢光定量pcr實時監測與dna結合的螢光染料激發的螢光,普通ocr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量。
3、二者反應要求不同
螢光定量pcr對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp,普通pcr可以擴增長點的片段。
4、二者應用不同
螢光定量pcr主要是用來定量分析和確定基因轉錄水平的,普通的pcr儀是做定性分析和擴增基因片段,定量pcr儀可以做普通pcr儀的工作,反之不行。
5、二者測量成本不同
定量pcr儀**較為昂貴,普通的基因擴增儀(pcr儀)只能夠定性地分析是否存在目標片段。但是**要低很多,而且執行成本也要低很多。
實時螢光定量pcr技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的侷限,實現了每一輪迴圈均檢測一次螢光訊號的強度,並記錄在電腦軟體之中,通過對每個樣品ct值的計算,根據標準曲線獲得定量結果。
10樓:匿名使用者
原理不同:螢光定量pcr實時監
測與dna結合的螢光染料激發的螢光;普通pcr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量,一般是紫外光。
反應要求:螢光定量對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp;普通定量可以擴增長點的片段。如果不需要檢測產物分子量大小,螢光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析,普通pcr必須電泳。
結果:螢光定量可以實現精確定量,普通pcr則不行。螢光定量體現可以看到整個擴增過程,可以看到擴增效率,溶解溫度,直接得到的標準曲線等,這些是普通pcr無法實現的。
如果還不清楚建議去丁香園等**逛逛,希望可以幫到你
11樓:匿名使用者
所謂實時螢光定量pcr技術,是指在pcr反應體系中加入螢光基團,利用螢光訊號積累實時監測整個pcr程序,最後通過標準曲線對未知模板進行「定量分析」的方法。
記住,實時螢光定量是定量分析
12樓:匿名使用者
螢光pcr是為了測量mrna表達量的 普通pcr是為了擴增目的片段的
13樓:匿名使用者
螢光定量是定量的,普通pcr是定性的,結果乙個是說明含有多少,另乙個說明有還是沒有,前者更精確一點
實時螢光定量pcr的原理
14樓:匿名使用者
螢光定量pcr原理:隨著pcr反應的進行,pcr反應產物不斷累計,螢光訊號強度也等比例增加。每經過乙個迴圈,收集乙個螢光強度訊號,這樣我們就可以通過螢光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條螢光擴增曲線圖。
螢光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為螢光探針(bioghc elitefast sybr kit)和螢光染料(bioghsc super probe kit)
15樓:匿名使用者
所謂的實時螢光定量 pcr 就是 通過對 pcr 擴增反應中每乙個迴圈產物螢光訊號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。其原理是在實時螢光定量 pcr 反應中,引入了一種螢光化學物質,隨著
pcr 反應的進行, pcr 反應產物不斷累計,螢光訊號強度也等比例增加。每經過乙個迴圈,收集乙個螢光強度訊號,這樣我們就可以通過螢光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條螢光擴增曲線圖。
實時定量pcr基本原理如何?
16樓:匿名使用者
實時pcr(real—time polymerase chain reaction)又稱螢光定量pcr或taqman pcr,是美國pe公司(perkin elmer)於2023年研製出的一種新的核酸定量技術。該技術在常規pcr基礎上運用螢光能量傳遞(fluorescence resonance energy transfer,fret)技術,加入螢光標記探針,巧妙地把核算擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術結合在一起,借助於螢光訊號來檢測pcr產物。一方面提高了靈敏度,另一方面還可以做到pcr每迴圈一次就收集乙個資料,建立實時擴增曲線,準確地確定ct值,從而根據ct值確定起始dna的拷貝數,做到真正意義上的dna定量。
另外由於ct值是乙個完全客觀的引數,ct值越小,模版dna的起始拷貝數越小。因此,利用ct值確定dna拷貝數實時pcr方法比普通終點定量方法更加準確。
pcr和實時螢光定量pcr這兩種有什麼區別
17樓:
原理不同:螢光定量pcr實時監測與dna結合的螢光染料激發的螢光;普通pcr通過檢測插入dna中核算染料的量來測定pcr最終產物量,一般是紫外光.
反應要求:螢光定量對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp;普通定量可以擴增長點的片段.如果不需要檢測產物分子量大小,螢光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析,普通pcr必須電泳.
結果:螢光定量可以實現精確定量,普通pcr則不行.螢光定量體現可以看到整個擴增過程,可以看到擴增效率,溶解溫度,直接得到的標準曲線等,這些是普通pcr無法實現的.
如果還不清楚建議去丁香園等**逛逛,希望可以幫到你
實時定量PCR的結果分析實時螢光定量PCR的結果該怎樣分析？
sybergreen可以和所有核酸結合，沒有特異性。所以要保證特異性的話，最好用其他的方法。擴增體系中加入模板dna的體積，比如同時10微公升的體系，對照組加1微公升dna，實驗組加2微公升dna，則實驗組的加樣量是對照組的2倍。看ct值是分析螢光定量pcr最直觀的乙個資料，ct值一般在35左右就失...
螢光定量PCR標準曲線,做實時螢光定量PCR實驗時,為什麼做標準曲線
具體情況要看你做的這個基因在兩個物種中的同源性。如果同源性很高,可以用同一對引物,回同一條探答 針的話,那我們就認為它在realtimepcr中的擴增效率是一樣的,標準曲線只要做一次就行了,對資料分析不會有影響 我要用ct法做螢光定量pcr,請問需要做標準曲線嗎 最好是做標準曲線,要看看擴增效率的....
實時螢光定量pcr不需要跑膠嗎,實時螢光定量PCR引物與普通PCR一樣嗎
不需要,不需要用瓊脂糖凝膠驗證。因為實時定量pcr那個儀器可以檢測螢光強弱,比膠要靈敏。假如用膠檢測mrna表達量,就不用螢光燃料,直接普通pcr就可以 實時螢光定量pcr 引物與普通pcr一樣嗎 實時定量的引物設計要求比較高,可以按普通引物設計的方法來做,但是設計時要注意擴增的片段不能太大,最好在...