1樓：匿名使用者
sybergreen可以和所有核酸結合，沒有特異性。所以要保證特異性的話，最好用其他的方法。擴增體系中加入模板dna的體積，比如同時10微公升的體系，對照組加1微公升dna，實驗組加2微公升dna，則實驗組的加樣量是對照組的2倍。
看ct值是分析螢光定量pcr最直觀的乙個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr螢光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右
2樓：藣軙粡膽覓掖付
如果有標準曲線，按照標準曲線計算。一般都是相對量。則用delta delta ct方法來計算。
舉例如下：對照組基因a的ct值為20， 內參（比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。
首先算加樣量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。
也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。
2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。
幾點注意： 1。必須確定擴增的特異性 2。
只有相同目標的ct值才能相減（擴增效率有可能不同） 3。 2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2。 4。
最好不用syber green
3樓：邶忠茹胭
pcr是聚合酶鏈式反應,通過反覆的變性退火延伸,達到將微量dna擴增檢測的目的。目前實驗室裡多採用的是實時螢光定量檢測,一起可以讀取每次迴圈的螢光強度,並記錄達到設定的閾值的迴圈次數。原始標本含有的dna量愈多,達到閾值迴圈數愈小。
通過已知濃度的標準品為對照,定量分析樣本所含的目的dna量。
實時螢光定量pcr的結果該怎樣分析？
4樓：群英鬥將
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算；
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算；
3、引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
4、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
5、看ct值是分析螢光定量pcr最直觀的乙個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr螢光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料：
pvr的迴圈引數：
1、預變性；
模板dna完全變性與pcr酶的完全啟用對pcr能否成功至關重要，加熱時間參考試劑說明書。
2、變性步驟；
迴圈中一般95℃，30秒足以使各種靶dna序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3、引物退火；
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
4、引物延伸；
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
5、迴圈數；
大多數pcr含25-35迴圈，過多易產生非特異擴增。
6、最後延伸；
在最後乙個迴圈後，反應在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，並使單鏈產物退火成雙鏈。
5樓：南京金益柏生物科技****
用2-△△ ct法算的話，應如何算？ 假設檢測a基因，ct分別為（這裡記住ct越大，表明相對含量越低） 普通組/test1：28 實驗組1/test2：
29 實驗組2/test3：30 這時候要設對照了，假設test1為對照組（普通組），當然是以普通組為對照 那麼，相對含量為。
6樓：匿名使用者
看ct值、起始拷貝數、標準偏差等
如果是sybr做的話，再看下溶解曲線
您好，我想問一下實時螢光定量pcr的資料分析！
7樓：傻蛋嘟嘟
用2-△△ ct法算的話，應如何算？
假設檢測a基因，ct分別為（這裡記住ct越大，表明相對含量越低）普通組/test1：28
實驗組1/test2：29
實驗組2/test3：30
這時候要設對照了，假設test1為對照組（普通組），當然是以普通組為對照
那麼，相對含量為：
普通組/test1：1
實驗組1/test2：2^-(28-29)=1/2=0.5實驗組2/test3：
2^-(28-30)=1/4=0.25a基因在實驗組1和實驗組2中的表達量，分別下降2倍和4倍！
所以，就出來啦，結果
對於每組不同部位的比較的話，將其中乙個處理為1進行比較嗎？
如實驗組1
testis
brain
liver
muscle
可以把任何乙個作為1，作為對照，但是要在figure 的legend中註明出來，說清楚就好了！
那對於三個組中的同一部位的比較的話，難道也要將其中一組處理為1嗎？
是的，可以，如
brain
普通組/test1
實驗組1/test2
實驗組2/test3
就以普通組/test1，為對照組，設為1，其他為相對含量，也要在figure 的legend中註明出來說清楚！
8樓：匿名使用者
這個很簡單。你把普通組的某個部位的相對量設為1。其他的，不管是組內的，還是組間的，都用△△ct的方法算出相對量。
再進行比較。基本概念就是設乙個點為基點，其他的都是相對值。不要每比一次都設乙個1。
實時螢光絕對定量pcr實驗資料分析哪個指標啊？
9樓：匿名使用者
ct,是從基線到指數增長的拐點所對應的迴圈次數，儀器中給出的ct就是你每個孔實際的ct值
ct mean,是你相同樣品的幾個重複的ct值得平均值如果是做的相對定量，用ctmean的結果就可以了，計算方法就是r＝2-δδct，現在很多儀器你只要設定的時候明確標出內參基因和目的基因，這個結果也是會有自帶軟體給計算出來的。
如果你是做絕對定量，那更方便，你只要在儀器設定的時候把你的標準品含量依次輸入，最後軟體會自動生成標準曲線什麼的，你最後只要分析og sq的結果就可以了。
10樓：匿名使用者
一般是分析他的ct，
如果是相對定量的話就是根據各樣品的ct值分析表達量的差異，
絕對定量的話就再看它的定量值，就是拷貝數
如何分析螢光定量pcr實驗結果
11樓：南京金益柏生物科技****
如果是realtime做表達
抄量，用襲excel的製圖，將每個個體的ct值平均數bai做出柱狀圖就可以了。du如果你還
zhi做了標曲的話，dao
就用製圖中的散點圖看r2值。
其實這些功能做定量pcr的時候電腦程式應該會自動分析才對，具體情況具體分析。
實時定量pcr的結果是怎樣分析的
12樓：小乾幹
1、如果有標準曲線，按照標準曲線計算。
2、一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算。
3、舉例如下：對照組基因a的ct值為20， 內參（比如βactin)ct值15。實驗組基因a ct值18，內參ct值14。
4、首先算加樣量：delta ct=15-14=1。2的1次方是2。
也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因a: delta ct=20-18=2。
2的2次方是4。也就是說基因a的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。
5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的ct值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用syber green。
13樓：豆村長de草
實時螢光定量pcr技術是在pcr反應體系中加入螢光基團，利用螢光訊號積累實時監測整個pcr程序，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
基線在pcr擴增反應的最初數個迴圈裡，螢光訊號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。光域值threshold的設定，一般將pcr反應前15個迴圈的螢光訊號作為螢光本底訊號，螢光域值是pcr3-15個迴圈螢光訊號標準差的10倍，螢光域值設定在pcr擴增的指數期。
融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，融解曲線就會出現一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個尖峰。
擴充套件資料：
時螢光定量pcr儀real-time qpcr 常見問題分析：
1、無ct值出現
1）檢測螢光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集，taqman法。則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號；
2）引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性；
3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；
4）模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
2、ct 值出現過晚（ct>38）
1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；
2）pcr各種反應成分的降解或加樣量不足，
3）pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
3、標準曲線線性關係不佳
1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；
2）標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新製備並稀釋標準品；
3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；
4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
14樓：匿名使用者
實時定量pcr的結果是可以和所有核酸結合，沒有特異性。
要保證特異性的話，最好用其他的方法。擴增體系中加入模板dna的體積，比如同時10微公升的體系，對照組加1微公升dna，實驗組加2微公升dna，則實驗組的加樣量是對照組的2倍。
看ct值是分析螢光定量pcr最直觀的乙個資料，ct值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用biodai-pcr螢光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。
擴充套件資料：
real-time qpcr 常見問題分析：
一、無ct值出現
1、檢測螢光訊號的步驟有誤：一般sg法採用72℃延伸時採集taqman法。
則一般在退火結束時或延伸結束採集訊號。
2、引物或探針降解：可通過page電泳檢測其完整性。
3、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
4、模板降解：避免樣品製備中雜質的引入及反覆凍融的情況。
二、ct 值出現過晚（ct>38）
1、擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等。
2、pcr各種反應成分的降解或加樣量不足。
3、pcr產物太長：一般採用80-150bp的產物長度。
三、標準曲線線性關係不佳
1、加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度。
2、標準品出現降解：應避免標準品反覆凍融，或重新製備並稀釋標準品。
3、引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針。
4、模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
四、負對照有訊號、溶解曲線不止乙個主峰
1、引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和髮夾結構的出現。
2、引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。
3、鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒。
4、模板有基因組的汙染：rna提取過程中避免基因組dna 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
五、擴增效率低
1、反應試劑中部分成分特別是螢光染料降解。
2、反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
3、反應體系中有pcr反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
實時螢光定量pcr的結果該怎樣分析
1 如果有標準曲線，按照標準曲線計算 2 一般都是相對量，則用delta delta ct方法來計算 3 引物或探針降解 可通過page電泳檢測其完整性 4 模板量不足 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起 5 看ct值是分析螢光定量pcr最直觀的乙個資料，ct值一般在35左右就失去參考價...
螢光定量PCR標準曲線,做實時螢光定量PCR實驗時,為什麼做標準曲線
具體情況要看你做的這個基因在兩個物種中的同源性。如果同源性很高,可以用同一對引物,回同一條探答 針的話,那我們就認為它在realtimepcr中的擴增效率是一樣的,標準曲線只要做一次就行了,對資料分析不會有影響 我要用ct法做螢光定量pcr,請問需要做標準曲線嗎 最好是做標準曲線,要看看擴增效率的....
實時螢光定量pcr不需要跑膠嗎,實時螢光定量PCR引物與普通PCR一樣嗎
不需要,不需要用瓊脂糖凝膠驗證。因為實時定量pcr那個儀器可以檢測螢光強弱,比膠要靈敏。假如用膠檢測mrna表達量,就不用螢光燃料,直接普通pcr就可以 實時螢光定量pcr 引物與普通pcr一樣嗎 實時定量的引物設計要求比較高,可以按普通引物設計的方法來做,但是設計時要注意擴增的片段不能太大,最好在...