1樓:養你過年吃肉
質粒是現代分
bai子生物學du中常用的載體之一,
質粒構建,zhi就dao是指把特定
的基因序列插入內到工程質粒容中。
但僅僅插入質粒是不夠的,還需要把質粒轉化到細菌、細胞或酵母中,使質粒在其中擴充套件或表達。以細菌為例,轉化後的細菌還需塗佈到平板,使之分散為單個細菌,在合適的條件下培養,單個細菌長成菌落,這時,這個菌落的所有的菌都是有乙個細菌**而來,其狀態和攜帶的質粒是一致的,就俗稱乙個「轉殖」,用於後續實驗。
從無性繁殖的角度來講,上述的「轉殖」和轉殖羊的「轉殖」概念是一致的。
2樓:匿名使用者
質粒構建應該就是構建轉殖。
構建質粒載體的大體步驟是什麼?
3樓:匿名使用者
(1)根據你已知的序列設計帶有酶切位點的引物。
(2)pcr,跑膠,看看你的目的條帶大小對不。
(3)條帶對的話再重新跑個大孔膠,然後切膠**。(具體步驟根據你們所用試劑盒上的說明書進行),切膠**後還需電泳,看你**後怎麼樣。
(4)拿著你的**液與你的ta載體進行連線(具體操作見載體試劑盒說明書)
(5)連線後要轉化進大腸桿菌感受態中。37°C 200rpm 搖菌乙個小時。
(6)之後塗佈至固體培養基上。(培養基是帶有抗生素的,這個抗生素的選擇要根據你的載體來選)
(7)37°C倒置培養一夜
(8)第二天早上,挑取單菌落,進行菌落pcr,檢測是否為假陽性。
(9)pcr之後如果條帶正確,則搖菌,搖的就是你檢測之後的那個單菌落。
(10)可以直接拿菌落測序,或者提取質粒測序。(記住要儲存菌種)
(11)如果測序得到的序列確實為你最初設定的那個序列,則再搖你儲存的那個菌種。
(12)提取質粒,做酶切。酶切的體系要看你所用的酶。
(13)酶切後還是需要進行**。
(14)將**的片段與你已經酶切好的表達載體的片段連線。
(15)再轉化至大腸桿菌擴增。
(16)pcr檢菌,酶切檢菌。
(17)檢菌正確,則你的表達載體構建完成。
因為我不知道你是否要構建到表達載體中,還是構建到轉殖載體就可以,所以後面說的不是很詳細,但是大體的步驟就是這樣,只要你會構建轉殖載體了,後面的表達載體基本也沒有問題了,只是多下些功夫就可以了。
我上面說的都是很簡單的語言,只供參考,不能作為書面語。有什麼問題可以再交流。
質粒構建的引物是什麼
4樓:匿名使用者
如果是需要把乙個特定的基因片段擴增後,插入到載體上構建質粒,則要根據載體上多轉殖位點帶有的酶切位點,在自己的目標基因片段上下游都分別設計一段序列,並在設計的序列中引入載體上的酶切位點。這個時候設計出來,用於完成pcr擴增,並能夠在目標序列上下游都引入酶切位點的兩段序列就叫做質粒構建引物。
這樣擴增獲得的目標片段兩端就帶有了酶切位點,經過酶切後,與同樣經過酶切的載體就可以連到一起,形成環狀,完成質粒的構建。
5樓:匿名使用者
取決於你的片段.............
質粒的構建策略是什麼?
6樓:匿名使用者
天然存在的野生型質粒由於分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷,不能滿足轉殖載體的要求,因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數幾個野生型質粒構建的。
很想知道質粒構建的詳細步驟?
7樓:匿名使用者
1. 通過pcr擴增目的基因片段
pcr要設計
引物,設計引物時要選擇合適的同源序列,根據質粒載體和基因序列要選擇合適的酶切位點,pcr的產物要純化。
2. 酶切
根據引物設計的酶切位點,分別對pcr產物和質粒載體進行酶切,酶切後的產物也要進行**
3. 連線
通過連線酶將酶切後的pcr產物和質粒載體進行連線4. 轉化
將連線產物轉化到受體菌中(一般為dh5a),塗板,培養過夜5. 挑取單轉殖,並鑑定
挑去平板上的單轉殖培養,可以通過pcr或者酶切初步鑑定陽性轉殖,對初步鑑定出來的陽性轉殖進行測序
8樓:匿名使用者
質粒的構建有很多方法,如果是pcr產物連線到t載體則使用t-a策略,如果是酶切連線剛需要t4連線酶進行連線。
你要是有天根全式金載體連線說明書就明白了。
表達載體和轉殖載體有什麼不同?
9樓:醉意撩人殤
表達載體和轉殖載體的區別:
1、性質不同
表達載體:生物學中,基因工程的基本操作,表達載體(expression vectors)就是在轉殖載體基本骨架的基礎上增加表達元件(如啟動子、rbs、終止子等),使目的基因能夠表達的載體。
轉殖載體:轉殖載體通常採用從病毒、質粒或高等生物細胞中獲取的dna作為轉殖載體,在載體上插入合適大小的 外源dn**段,並注意不能破壞載體的自我複製性質。
2、組成不同
表達載體:表達載體四部分:目的基因、啟動子、終止子、標記基因。
轉殖載體:常見的載體有質粒、噬菌粒、酵母人工染色體。
10樓:
轉殖載體是在轉殖過程中用到的各種質粒,比如為了擴增目的基因的高拷貝質粒、為了方便測序的測序質粒、為了連線pcr產物的ta質粒、為了重組的穿梭質粒等等。轉殖載體一般有較強的複製能力,利於基因的儲存和擴增,而且提供豐富的酶切位點等等。它不必有強啟動子,因為不重於表達。
表達載體是基因轉殖結束後,為了在特定細胞內表達而構建的。他重點在於表達,有各種各樣的啟動子適應於不同種類的細胞,並且有各種各樣,如誘導等可控的表達調控方式。
11樓:匿名使用者
表達載體是用來表達該載體上的某某基因而設計的載體;轉殖載體是用來轉殖該載體上的某某基因而設計的載體。
12樓:鈕風忻方雅
轉殖載體一般是原核細菌
將需要轉殖的基因與轉殖載體的質粒相連線
在匯入原核細菌內
質粒會在原核細菌內大量複製
形成大量的基因轉殖
被轉殖的基因不一定會表達
但一定被大量複製
而表達載體是一些用於工程生產的細菌
他們被匯入目標基因
這些目標基因會在此類細菌中得到表達
生產出我們需要的產物
匯入的基因是有轉殖載體產出的
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