1樓:元霜
轉化實驗用bai液態的lb是為了讓細du胞恢復培
zhi養,也有人稱
之為讓其孵育,質dao粒或其他經專在液態lb中恢復屬培養後再塗佈平板(固態培養基),是為了分散開,以培養單轉殖。一般經37度倒置培養12-16h後,就可以看到有單個轉殖長出,就可挑取了。
如何製備大腸桿菌感受態細胞
2樓:匿名使用者
大腸桿菌感受態細胞的製備和轉化
準備:一. 材料
e. coli dh5α菌株: rˉ,mˉ,ampˉ;pbs質粒dna: 購買或實驗室自製,eppendorf管。
二. 裝置
恆溫搖床,電熱恆溫培養箱,台式高速離心機,無菌工作台,低溫冰箱, 恆溫水浴鍋, 製冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.lb固體和液體培養基
2.amp母液
3.含amp的lb固體培養基:將配好的lb固體培養基高壓滅菌後冷卻至60°C左右,加入amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻後鋪板。
4.麥康凱培養基(maconkey agar):取52g麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌,待冷至60°C左右加入amp儲存液使終濃度為50ug/ml,然後搖勻後塗板。
5.0.05mol/l cacl2溶液:稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/l cacl2: 稱取0.28g cacl2(無水,分析純),溶於50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
操作步驟:
一、 受體菌的培養
從lb平板上挑取新活化的e. coli dh5α單菌落,接種於3-5ml lb液體培養基中,37°C下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:
100-1:50的比例接種於100ml lb液體培養基中,37°C振盪培養2-3小時至od600 =0.5左右。
二、 感受態細胞的製備 ( cacl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10分鐘,然後於4°C下3000g離心10分鐘。
2、 棄去上清,用預冷的0.05mol/l的cacl2 溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30分鐘後,4°C下3000g離心10分鐘。
3、棄去上清,加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/l的cacl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、 感受態細胞分裝成200μl的小份,貯存於-70°C可儲存半年。
三、 轉化
1、從-70°C冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
2、 加入pbs質粒dna溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
3、42°C水浴中熱擊90秒或37°C水浴5分鐘,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4、向管中加入1ml lb液體培養基(不含amp),混勻後37°C振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因(ampr )。
5、將上述菌液搖勻後取100μl 塗佈於含amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37°C培養16-24小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的lb平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替dna溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗佈於不含抗生素的lb平板上,此組正常情況下應產生大量菌落。
四、 計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下:
轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/塗板菌液體積
轉化頻率**化子數/每mg質粒dna)=轉化子總數/質粒dna加入量(mg)
感受態細胞總數=對照組2菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/塗板菌液體積
感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用於其它e.coli受體菌株的不同的質粒dna的轉化。但它們的轉化效率並不一定一樣。
有的轉化效率高,需將轉化液進行多梯度稀釋塗板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,塗板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
在大腸桿菌感受態細胞的製備及轉化實驗中 5
3樓:翦子美女
兩個目的:1熱激後的大腸桿菌細胞比較脆弱,培養可以恢復細胞的活性;2進一步培養,提高菌液中大腸桿菌的濃度。
感受態細胞的製備和轉化中 為什麼要加兩次cacl2?cacl2為什麼要預冷
4樓:就喜歡理財
方法一: 細菌轉化的方法多以mendel和higa(1970)的發現為基礎,其基本方法是用冰預冷的cacl2或多種2價陽離子等處理細菌,使之進入感受態得以轉化。 用cacl2製備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞,常用於成批製備感受態細菌。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
5樓:阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態,這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙,便於轉化質粒。
大腸桿菌dh5a感受態細胞與大腸桿菌bl21感受態細胞有什麼區別
首先，這兩種菌的基因型不一樣，這就導致了這兩種菌有不同的用途 dh5a是用於轉殖的，構建質粒，建庫，保藏質粒，等等，用的是它。bl21是專門用來表達蛋白的，如果用於儲存質粒，質粒會很不穩定。大腸桿菌hb101與大腸桿菌dh5 有什麼區別 dh5 菌株copy是一種能夠攝入外源dna的受容菌，普通的大...
氯化鈣法製備新鮮大腸桿菌感受態細胞時為什麼要求od值在
你可以在活化菌培養兩小時過後,每隔二十分鐘測一下od值.這樣還是比較好的,各個批次的菌生長也是不同的.理工學科是什麼 理工學科是指理學和工學兩大學科。理工，是乙個廣大的領域包含物理 化學 生物 工程 天文 數學及前面六大類的各種運用與組合。理學理學是中國大學教育中重要的一支學科,是指研究自然物質運動...
感受態細菌的名詞解釋，感受態細胞（細菌），什麼是感受態細胞
經過適當處理後容易接受外來dna進入的細菌。如大腸桿菌經cacl2處理，就成為容易受質粒dna轉化的細胞。感受態細胞 細菌 什麼是感受態細胞 野生型e.coli並不容易轉化，這是由於細菌產生一種酶能迅速降解進入的外源dna。經過多年的努力，科學家們發現了一種方法可以增加細胞吸收外源dna的效率。那就...