1樓：lee羅亞輝
1、長度：15—30bp，其有效長度[ln=2(g十c)十(a十t)]一般不大於38，否則pcr的最適延伸溫度會超過taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產物的特異性。
2、g十c含量：應在40%一60%之間，pcr擴增中的復性溫度一般是較低tm值引物的tm值減去5—10度。引物長度小於20時，其tm恆等於4×(g十c)十2×(a十t)。
3、鹼基分布的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一鹼基。尤其是不應在其3』端出現超過3個的連續g或c，否則會使引物在g十c富集序列區錯誤引發。
4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成髮夾樣二級結構。
5、引物之間：兩個引物之間不應有多於4個的互補或同源鹼基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3』端的互補重疊。
6、上下游引物的互補性：乙個引物的3『末端序列不允許結合到另乙個引物的任何位點上。
7、3』末端：如果可能的話，每個引物的3『末端鹼基應為g或c。
8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。
擴充套件資料
引物合成
1、是將預先連線在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團dmt，獲得游離的5′-羥基。
2、合成dna的原料，亞磷醯胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被dmt保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。
4、在氧化劑碘的作用下，亞磷醯形式轉變為更穩定的磷酸三酯。
2樓：灰原哀
一般使用primer5就挺好，不知道你是擴基因還是啟動子，基因是否是已知。
pcr引物設計原理:
pcr引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。因此，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。
要設計引物首先要找到dna序列的保守區。同時應**將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。
如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
現在可以在這一保守區域裡設計一對引物。一般引物長度為15~30鹼基，擴增片段長度為100~600鹼基對。
讓我們先看看p1引物。一般引物序列中g+c含量一般為40%~60%。而且四種鹼基的分布最好隨機。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則p1引物設計的就不合理。應重新尋找區域設計引物。
同時引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多於4個連續鹼基的互補。
引物確定以後，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、螢光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這裡還需提醒的是3′端不要終止於密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發生簡併，會影響擴增的特異性與效率。
臨床實驗室
pcr引物的設計原則：
① 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
② 產物不能形成二級結構。
③ 引物長度一般在15~30鹼基之間。
④ g+c含量在40%~60%之間。
⑤ 鹼基要隨機分布。
⑥ 引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
⑦ 引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
⑧ 引物5′端可以修飾。
⑨ 引物3′端不可修飾。
⑩ 引物3′端要避開密碼子的第3位。
pcr引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。如前述，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保pcr的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
1.引物的特異性
引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補鹼基同源。
2.避開產物的二級結構區
某些引物無效的主要原因是引物重複區dna二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計mrna的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g°）小於58.
6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧gtp取代dgtp對擴增的成功是有幫助的。
3.長度
寡核苷酸引物長度為15~30bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：ln=2（g+c）+（a+t+，ln值不能大於38，因為》38時，最適延伸溫度會超過taq dna聚合酶的最適溫度（74℃),不能保證產物的特異性。
4.g+c含量
g+c含量一般為40%~60%。其tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高於tm值5~10℃。若按公式tm=4（g+c）+2（a+t）估計引物的tm值，則有效引物的tm為55~80℃，其tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
5.鹼基礎隨機分布
引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的g或c，因這樣會使引物在g+c富集序列區錯誤引發。
6.引物自身
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補鹼基不能大於3bp。
7.引物之間
兩引物之間不應不互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多於4個連續鹼基的同源性或互補性。
臨床實驗室
8.引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的pcr（as-pcr）反應中，引物3′端不能發生錯配。
在標準pcr反應體系中，用2u taq dna聚合酶和800μmol/l dntp（四種dntp各200μmol/l）以質粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的迴圈引數擴增hiv-1 gag基因區的條件下，引物3′端錯配對擴增產物的影響是有一定規律的。a∶a錯配使產量下降至1/20，a∶g和c∶c錯七下降至1/100。引物a：
模板g與引物g：模板a錯配對pcr影響是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定著pcr產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：
加酶切位點；標記生物素、螢光、地高辛、eu3+等；引入蛋白質結合dna序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10.密碼子的簡併
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增特異性與效率。
「引物」設計的原則是什麼？
3樓：匿名使用者
引物設計有 3 條基本原則：
引物與模板的序列要緊密互補。
引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構。
再次引物不能在模板的非目的位點引發dna聚合反應(即錯配)。
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，乙個引物與目的基因一端的一條dna模板鏈互補，另乙個引物與目的基因另一端的另一條dna模板鏈互補。
在pcr（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一串行合成引物，利用pcr擴增技術，目的基因dna受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在dna聚合酶作用下進行延伸，如此重複迴圈，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。
pcr引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板dna序列。如前述，引物的優劣直接關係到pcr的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅永珍的規則確保pcr的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
引物設計有 3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發dna聚合反應(即錯配)。具體實現這 3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列 tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用 ∆g 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及髮夾結構（duplexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的gc 含量（***position），等等。
必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。
做real time時,用於sybr green i法時的一對引物與一般pcr的引物,在引物設計上所要求的引數是不同的。引物設計的要求：
避免重複鹼基，尤其是g。
tm=58-60度。
gc=30-80%。
3'端最後5個鹼基內不能有多於2個的g或c。
正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
pcr擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。
引物的退火溫度要高，一般要在60度以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組dna汙染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組dna汙染的影響。
做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做汙染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。
關於blast的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在genebank中公開的全部物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。
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